Introduction

Interferons  are  natural  cytokines  in  body.  The  term  “interferon”  defines  biological  activity  of  soluble  materials  that  interfere  with  virus  replication  process.  Interferons  are  expressed  in  response  to  a  variety  of  antigens,  including  Viral  RNA,  bacterial  productions  and  tumor  proteins  (1).  Generally,  interferons  are  divided  into  three  groups  based  on  amino  acid  sequences.  Group  I  consists  of  α,  β,  ε,  δ,  ω,  κ  interferons  while  the  group  II  only  has  a  member  called  interferon  γ  .Group  III  of  interferons  has  recently  been  identified  and  included  members  λ1,  λ2  and  λ3  and  play  an  important  role  in  direct  response  to  viral  infections(2).  Interferons  can  be  divided  into  three  groups  based  on  their  cellular  origin.  Interferon  α  with  the  origin  of  Leukocyte  cell  (leukocyte  interferon),  interferon  β  with  the  origin  of  fibroblasts  cells  (fibroblast  interferon)  and  interferon  γ  with  the  origin  of  lymphocytes  cells  (immune  interferon)  are  in  this  division  (3  and  4).  Interferon  α  and  β  in  Group  I  of  interferon  family  have  an  important  role  in  suppression  of  viral  infections  and  inflammation  (5).  Today,  two  completely  different  strategies  utilize  to  produce  different  forms  of  recombinant  interferon  beta.  IFNβ-Ia  form  general  is  the  name  of  drugs  produced  in  CHO  cell  lines  and  IFNβ-Ib  is  the  name  of  drugs  that  produce  with  using  of  E.Coli  based  expression  system.  In  times  past,  production  of  recombinant  IFNβ    in  E.  coli  cells  had  some  problems  such  as  dimerization  and  oligomerization  of  IFNβ  resultant  from  this  method  which  cause  isolation  of  beta-interferon  very  difficult  and  time-consuming  (4,  6  and  7).  In  addition,  it  was  found  that  produced  IFNβ  by  microbial  methods  always  show  lower  specific  activity  than  the  natural  form  (8).  Therefore  in  the  biopharmaceutical  industry,  mammalian  cell  culture  systems  are  preferred  (9).  In  this  study,  expression  level  of  human  IFNβ  gene  will  be  examined  in  human  embryonic  kidney  (HEK293T)  cell  line  transfected  with  the  pBud.  IFNβ  -1a  gene  structure  with  using  of  protein  tests  such  as  Dot  blot  and  Elisa.

Materials  and  Methods

Primer Design and construction  of  recombinant  pBud.IFNβ  -1a  structure

In  order  to  evaluation  of  the  expression  level  of  IFNβ  mRNA,  pSVMdhfr  vector  containing  human  IFNβ  gene  was  used  as  a  template  for  PCR.  Specific  primers  were  designed  with  using  of  the  Oligo7  software  (Molecular  Biology  Insight,  USA)  in  a  way  to  allow  amplification  of  the  gene  coding  region  of  the  human  IFNβ  from  pSVMdhfr  vector  to  be  provided.  In  the  F  and  R  primers,  sequences  related  to  the  Kpn  I  and  Bgl  II  enzymes  recognition  sites  was  placed  in  order  to  cloning  of  IFNβ  fragment  in  the  pBud.CE4.1  expression  vector.  Using  of  GG  nucleotides  before  KpnI  restriction  site  in  the  forward  primers  and  TC  nucleotides  after  BglII  enzyme  restriction  site  in  the  reverse  primer  provide  possibility  of  detecting  enzyme  restriction  site.  Design  of  reverse  primer  is  in  the  way  that  stop  codon  TGA  is  removed  with  the  aim  of  trace  ability  of  produced  protein  with  using  of  Anti-His  Tag  antibody.  For  this  reason  and  follow-up  to  preserve  of  gene  reading  frame  and  expression  of  histidine  sequence  GA  nucleotides  placed  before  KpnI  restriction  enzyme  site.  One  of  the  important  factors  that  effect  in  translation  is  the  presence  of  proper  sequence  surrounding  translation  start  codon  or  the  Kozak  sequence,  so  that  the  amount  of  synthesized  protein  of  one  mRNA  is  related  to  the  Kozak  sequence.  Changing  of  Kozak  sequence  in  order  to  close  it  to  constant  form  can  help  in  increasing  of  translation  level.  IFNβ  gene  Kozak  sequence  in  some  positions  is  different  from  kozak  conserve  sequence.  Kozak  constant  sequence  is  in  “GCCRCCAUGG”  form  that  R  represents  a  purine  base.  Kozak  Sequence  of  IFNβ  gene  is  in  “GUCAACAUGA”  form.  So,  to  close  this  sequence  to  constant  Kozak  sequence,  two  nucleotides  in  place  -2  and  -5  (according  to  transcription  start  site)  must  be  changed  to  C  base.  Therefore,  “GCCACCATGACC”  nucleotide  sequence  related  to  Kozak  conserved  form  placed  in  forward  primer  after  KpnI  restriction  site.  Designed  primers  were  prepared  by  Kowsar  Gene-Fanavaran-IRAN  Company  in  lyophilized  powder  form.  PCR  reaction  was  done  according  to  95  °C  Protocol  for  6  minutes,  followed  by  35  cycles  of  94  °  C  for  30  seconds,  60  °  C  for  30  seconds  and  72  °  C  for  50  seconds  and  a  final  cycle  72  °  C  for  10  minutes.

FP  IFNβ:  5′-GGGGTACCGCCACCATGACCAACAAGTGT-3′

RP  IFNβ:  5′-GAAGATCTTCGTTTCGGAGGTAACCTG  -3′

The  amplified  fragment  was  purified  by  gel  extraction  kit  (Thermo  Scientific,  USA).  At  the  same  time,  pBud.CE4.1  vector  was  linearized  with  Kpn  I  and  Bgl  II  enzymes.  At  last,  amplified  fragment  cloned  in  linear  vector  by  T4  DNA  ligase  enzyme.  Ligation  mixture  was  transformed  to  the  competent  E.  coli.TOP10  bacteria  by  standard  thermal  shock  method.  The  colonies  containing  the  recombinant  vector  were  selected  on  LBA  plate  with  the  final  50  μg  /  ml  Zeocin  antibiotic  concentration.  Recombinant  colonies  verified  via  Colony  PCR  method  and  then  plasmid  extraction  was  carried  on  positive  colonies.  RFLP  analysis  with  KpnI  and  BglII  enzymes  and  DNA  sequencing  with  using  of  Bgh  Rev  universal  primers  of  Fazabiotech-Iran  Company  were  done.

Cell culture, transfection and protein extraction

After  validation  of  recombinant  construction’s  structure,  HEK293T  cells  were  transfected  with  using  of  Lipofectamine®  LTX  plus™  reagent  (Invitrogen,  USA)  kit.  48  hours  after  transfection,  culture  medium  was  isolated  and  cells  were  washed  with  using  of  PBS  buffer  and  then  were  detached  from  flask  with  using  of  0.05  percent  of  trypsin.  Cells  were  transferred  to  a  falcon  and  were  centrifuged  with  1700  rpm  for  5  minutes.  After  providing  cell  sediment,  different  protein  extraction  process  was  done  with  using  of  TRizol  purchased  from  Life  Technologies  Company.

Protein detection

Protein  was  extracted  from  two  phases  of  cell  culture  environment  (in  order  to  study  the  possibility  of  secretory  protein  IFNβ  in  the  environment)  and  cell  lysis  related  to  transfected  cells  with  recombinant  vector,  un-transfected  control  cells  and  transfected  cells  with  null  vector  lacking  recombinant  gene  with  using  of  Trizol  of  Life  Technologies  with  15596-026  catalog  number  and  according  to  company  instruction.  Concentration  of  obtained  proteins  were  calculated  with  the  help  of  Bradford  standard  curve.  With  the  aim  of  semi-quantitative  analysis  of  protein  expression,  in  each  steps,  same  concentration  of  proteins  were  used.

Dot blotting technique

Dot  blot  is  a  specific  method  for  identification  and  semi-quantification  analysis  of  proteins  in  unknown  samples.  At  this  step,  a  volume  equivalent  to  24micrograms  concentration  of  extracted  proteins  from  two  phases  of  cell  culture  environment  and  cell  lysis  were  loaded  onto  nitrocellulose  paper.  1%  SDS  protein  solvent  buffer  as  negative  control  and  GFP-SCFV  protein  as  positive  control  were  used.  After  drying  at  room  temperature,  the  membrane  blocked  by  an  appropriate  volume  of  blocking  solution  (milk  powder  +  PBS)  over  a  night  at  room  temperature  with  mild  agitation  on  a  95  RPM  shaker.  Then  after  three  times  washing  in  cold  wash  buffer  (PBS  +  Tween20)  anti-His  tagged  antibody  conjugated  with  HRP  enzyme  with  proper  dilution  1/1000  (4  ml  antibody  +  4  ml  of  blocking  buffer)  used  for  identification  step  of  recombinant  protein.  After  three  washing  times  in  PBS  soluble,  nitrocellulose  papers  were  treated  by  this  enzyme’s  substrate  (TMB).

Figure 1: result  of  PCR  reaction  on  pSVMdhfr-IFNβ  vector  for  IFNβ  gene  amplification.  564  bp  fragment  of  IFNβ  was  successfully  amplified  from  vector.  M  represents  the  size  marker  with  the  length  of  100  bp  (Fermentas).    Click here to View figure

Elisa

ELISA  or  enzyme-linked  immune  sorbent  assays  is  a  biochemical  method  that  basically  is  used  in  order  to  define  the  presence  of  an  antibody  or  an  antigen  in  studied  samples.  Result  of  ELISA  is  a  colored  reaction  which  is  visible  with  eyes  that  has  been  read  with  using  of  multichannel  spectrophotometer  and  data  records  and  analyses,  too.  In  this  study,  conjugated  Monoclonal  Anti-poly  Histidine  antibody  with  HRP  enzyme  was  used  to  define  concentration  of  produced  IFNβ  in  HEK293T  cell-line.  After  protein  extraction  with  use  of  TRizol  and  determining  hole  protein  concentration  via  Bradford  method,  same  density  equivalent  of  25  micro  gram  in  micro  liter  of  all  samples  and  control  protein,  GFP-SCFV,  which  has  identification  sequence  of  histidine  were  selected  in  order  to  loading  in  ELISA  plate  sinks.  Selection  of  same  density  was  for  semi-quantitative  studies  and  providing  completely  same  conditions  for  all  samples.  SDS  buffer  which  was  protein  solvent  in  the  last  step  of  protein  extraction  with  the  use  of  TRizol  was  used  as  negative  control.    After  observing  color  change  from  blue  to  yellow  in  samples  in  result  of  adding  TMB,  stop  solutions  were  added  and  then  result  read  by  multichannel  spectrophotometer,  quickly.

Results

pBud.  IFNβ-1a  structure  construction   

PCR  of  IFNβ  gene  was  performed  on  PSVMdhfr  vector  containing  the  gene  with  using  of  designed  primers  and  a  product  with  564  bp  length  was  amplified  (Figure  1).  After  the  cloning  process,  digestion  with  two  KpnI  and  BglII  enzymes  was  performed  on  recombinant  vector,  and  exit  of  564  bp  IFNβ  fragment,  confirmed  correct  entrance  of  fragment  in  the  pBud.CE4.1  vector  (Figure  2).

Figure 2: double  digestion  on  the  recombinant  plasmid.  Column  1  shows  the  negative  control  (uncut  vector),  column  2  represents  linearized  vector  with  a  length  of  4595  bp  and  IFNβ  gene  with  a  length  of  564  bp.  M1  is  size  marker  with  the  length  of  1kbp  and  M2  is  the  size  marker  with  the  length  of  100  bp  (Fermentas).   Click here to View figure

pBud.  IFNβ-1a  transfection  into  HEK293T  cell  line

Recombinant  plasmid  was  transfected  into  HEK293T  cell-line  using  Lipofectamine  kit  (Invitrogen,  USA).  Moreover,  in  a  separate  reaction,  the  vector  without  entering  segment  was  transfected  into  cells.  In  another  flask,  un-transfected  HEK293T  cells  were  cultured  as  control  cells.

Protein  tests

Dot  blot  reaction  was  performed  to  investigate  the  probability  of  producing  IFNβ  protein  (Figure  3).  In  order  to  final  approval  of  IFNβ  protein  and  performing  quantitative  and  comparative  calculations,  ELISA  reaction  was  carried  out,  the  results  are  shown  in  Figure  4.

Figure 3: representation  of  produced  IFNβ  protein  in  HEK293T  cell  line  using  dot  blot  method.  A)  Protein  extracted  from  cultured  cells  transfected  with  recombinant  pBud.IFNβ-1a  vector.  B)  Protein  extracted  from  lysed  cells  transfected  with  recombinant  pBud.IFNβ-1a  vector.  C)  Positive  control  protein  (GFP-Scfv-His6)  D)  Negative  control  (Un-transfected  HEK293T  cells).   Click here to View figure

Figure 4: Quality  comparing  of  the  produced  IFNβ  protein  in  HEK293T  cells  in  two  phases  of  cell  culture  and  cell  lysis.  Positive  control  is  GFP-Scfv  protein  and  negative  control  are  non-transfected  HEK293T  cells   Click here to View figure

Discussion

Cytokines  are  cell  active  factors  that  are  produced  in  a  sustainable  manner  in  response  to  a  wide  range  of  triggers  (not  only  antigens).  The  significant  feature  of  cytokines  is  the  effect  on  cellular  mechanisms  and  causing  behavioral  changes  in  target  cells  under  certain  circumstances  (10).  Interferons  were  introduced  as  the  first  group  of  cytokines.  Human  IFNβ  (IFN-β)  is  a  glycoprotein  that  is  widely  produced  in  response  to  viral  infections  in  fibroblasts  cells.  That  is  why  it  is  called  fibroblast  interferon.  IFNβ  is  used  in  the  field  of  medicine,  in  order  to  treat  and  improve  autoimmune  diseases  including  sclerosis  (MS),  cell  proliferation  and  angiogenesis  inhabitation,  and  thereby  cancer  and  viral  infections  treatments.  Two  analogs  of  IFNβ  are  used  as  drug  in  the  treatment  of  MS  (12).  The  first  type  is  non-glycosylated  form  of  protein  is  known  as  IFNβ-1b  which  is  expressed  in  E.  coli  and  is  currently  on  the  market  under  the  trade  name  known  BetaSeron.  Glycosylated  form  of  this  protein  is  IFNβ-1a  with  the  trade  names  of  Avonex  and  Rebif  that  both  are  expressed  in  ovarian  cells  of  Chinese  hamster  (CHO).  The  efficiency  of  IFNβ-1b  produced  in  bacteria  is  lower  compared  to  glycosylated  form,  so  that  to  achieve  the  efficiency  in  accordance  with  the  IFNβ-1a,  it  is  necessary  to  prescribe  a  higher  dose  of  IFNβ-1b  (13).  Continuous  injection  of  this  drug  triggers  the  production  of  neutralizing  and  non-neutralizing  antibodies  against  the  IFNβ  which  inhibits  the  biological  effects  of  drug  and  reduce  its  effectiveness.  These  factors  cause  lowering  the  treatment  efficiency  and  side  effects  such  as  flu-like  symptoms,  liver  damage,  decreased  white  blood  cells  and  platelets,  depression  and  headache  in  patient  (14).  To  overcome  these  problems,  other  expression  hosts  such  as  yeasts,  filamentous  fungi,  insect  cells  and  plant  cells  can  be  used,  but  these  hosts  due  to  different  glycosylation  pattern  from  human  are  less  used  (15،  16  and  17).  HEK293T  is  a  derived  cell  line  from  human  embryonic  kidney  cells  that  grows  in  cell  culture  and  has  been  altered  to  cancer  cells  via  transfecting  with  adenovirus  type  5  DNA.  The  cells  are  morphologically  similar  to  epithelial  cells  and  are  known  as  one  of  the  best  cell  lines  for  the  expression  of  recombinant  proteins,  and  the  production  of  viral  vectors  and  vaccines  in  both  transient  and  stable  expression  since  25  years  ago  (18,  19).  Therefore,  in  this  study  HEK293T  cells  have  been  used  for  the  expression  of  recombinant  interferon  beta.

Conclusion

In  this  study  the  expression  of  recombinant  plasmids  containing  IFNβ  gene  in  HEK293T  cell  line  were  reviewed  and  approved  with  using  of  Dot  blot  and  ELISA  tests.  All  tests  show  successful  expression  of  recombinant  IFNβ  protein  in  the  selected  cell  line.  This  could  be  due  to  existence  of  eEf1a  strong  promoter  in  the  selected  vector  and  also  development  of  conserved  Kozak  sequence  for  IFNβ  protein  using  designed  primers  for  gene  cloning.  Start  speed  of  translation  by  ribosome  to  a  large  extent  depends  on  the  Kozak  sequence  in  the  vicinity  of  the  start  codon,  and  the  produced  protein  amounts  is  dependent  on  the  strength  of  the  sequence  (21).  In  this  study,  by  changing  two  nucleotide  -2  and  -5  in  Kozak  sequence  and  convert  it  to  conserved  form,  the  protein  expression  level  shows  significant  increasing  compared  to  basic  expression  in  the  cell.  Briefly,  in  a  conclusion  it  can  be  stated  that  IFNβ  gene  expression  level  has  been  increased  significantly  due  to  cloning  in  pBud.CE4.1  vector  under  strong  eEf1a  promoter.  So  the  selected  cell  line  and  vector  meet  good  conditions  for  producing  intended  pharmaceutical  protein.  In  addition,  changing  Kozak  sequence  of  IFNβ  gene  and  convert  it  to  stable  and  conserved  form  has  significant  effect  on  increasing  gene  expression  level.  Considering  the  transient  expression  of  this  protein  in  fibroblast  cells,  it  is  needed  to  produce  more  and  more  interferon  protein.

Acknowledgement

This  article  is  produced  by  using  of  Ms.  Raheleh  Norouzi  Master’s  thesis  and  research  plan  (92042856)  data.  Hereby,  the  Department  of  Biology  of  Isfahan  University  and  the  Iran  national  science  foundation  are  sincerely  appreciated  for  providing  facilities  and  equipment  for  this  study.

References

1. Chelbi-Alix,  M.  K.  and  Wietzerbin,  J.  .  Interferon,  a  growing  cytokine  family:  50  years  of  interferon  research.  Elsevier.  2007; (89) 713-718
2. Pestka,  S.,  C.  D.  Krause,   et al.  “Interferons,  interferon  like  cytokines,  and  their  receptors.”Immunological   reviews. 2004; 202(1):  8-32.
   CrossRef
3. Pang,  K.  .  Biological  and  clinical  basis  for  molecular  studies  of  interferons.  Springer.  2005; 116:1
   CrossRef
4. Zago,  P.,  Baralle,  M.,  Ayala,  P.M.,  Skoko,  N.,  Zacchigna,  S.  .  Improving  human  interferon  production  in  mammalian  cell  lines  by  insertion  of  an  intronic  sequence  within  its  naturally  uninterrupted  gene.  Wiley  Online  Library.  2009; (52)191-198
5. Friedman,  R.  M.  .  Clinical  uses  of  interferons.  Wiley  Online  Library.  2008; (65) 158-162
6. Mark,  DF,  lin,  Sl.  And  Yulu,  SD.  .  Human  recombinant  cysteine  depleted  interferon-θ  muteins.  1966 US patent 4588585.
7. Runkel,  L.,  Meier,  W.,  Pepinsky,  R.B.,  Karpusas,  M.,  Whitty,  A.,  Kimball,  K  .  Structural  and  functional  differences  between  glycosylated  and  non-glycosyated  forms  of  human  interferon-beta  (IFNbeta).  Pharmaceutical  research.  1998; 15(4):  641-9
   CrossRef
8. Runkel,  L.  .  Structural  and  functional  differences  between  glycosylated  and  non-glycosylated  forms  of  human  IFNβ  (IFN-beta).  Springer.  1998; (15)641-649.
9. Patrick, H., and sarwat, F.  Optimal  and  consistent  protein  glycosylation  in  mammalian  cell  culture.  Glycobiology.  2009; (19)936-949.
10. Morris,  A.  and  I.  Zvetkova.  “Cytokine  research:  the  interferon  paradigm.”  Journal  of  clinical  pathology  1997; 50(8):  635-639.
    CrossRef
11. Pestka,  S.  and  Baron,  S.  .  Definition  and  classification  of  the  interferons.  Methods  in  Enzymology.  1981; (78) 3-14.
    CrossRef
12. Meyer,  O.  .  Interferons  and  autoimmune  disorders.  Joint  Bone  Spine.  2009; 76(5):  464-473.
    CrossRef
13. Bertolotto,  A.,  Deisenhammer,  F.,  Gallo,  P.,  et  al.  .  Immunogenicity  of  interferon  beta:  differences  among  products.  Journal  of  Neurology.  2004; 251(2):  II15-II24.
    CrossRef
14. Giovannoni,  G.,  Munschauer,  F.  and  Deisenhammer,  F.  .  Neutralising  antibodies  to  IFNβ  during  the  treatment  of  multiple  sclerosis.  Journal  of  Neurology,  Neurosurgery  and  Psychiatry.  2002; 73(5):  465-469.
    CrossRef
15. Skoko,  N.,  Argamante,  B.,  Grujicić,  N.  K.,  et  al.  .  Expression  and  characterization  of  human  IFNβ  in  the  methylotrophic  yeast  Pichia  pastoris.  Biotechnology  and  Applied  Biochemistry.  2003; 38(3):  257-265.
    CrossRef
16. Smith,  G.  M.,  Summers  ,  M.  D.  and  Fraser,  M.  J.  .  Production  of  human  IFNβ  in  insect  cells  infected  with  a  baculovirus  expression  vector.  Molecular  and  Cellular  Biology.  1983; 3(12):  2156-2165.
    CrossRef
17. Squires,  C.  H.  Human  Interferon  Beta-1b  Production  in  Pseudomonas  fluorescens.  .  BioProcess  International.  2010; 8(7):  132.
18. Ebtekar,  M.,  K.  Azadmanesh,  et  al.  “Cloning  Of  Human  Ifn-1″  (Il-29)  From  Monocyte  Derived  Dcs  And  Its  Expression  In  Hek  293  T.”  Arak  Medical  University Journal  (Amuj).
19. Thomas,  P.  and  Smart,  T.  G.  HEK293  cell  line:  a  vehicle  for  the  expression  of  recombinant  proteins.  Journal  of  pharmacological  and  toxicological  methods.  200551(3),  187-200.
20. Pfaffl,  M.W.  Quantification  strategies  in  real-time  PCR.  AZ of quantitative PCR 2004; 1:89-113.
    CrossRef
21. Kozak  M,  Evans  M,  Gardner  PD,  et  al.  Structural features in eukaryotic mRNAs that mod.  Boil Chem. 1991; 2619870-6:19867.